熒光檢測(cè) PCR 定量檢測(cè)，即實(shí)時(shí)熒光定量 PCR（qPCR），其原理是在普通 PCR 的基礎(chǔ)上，加入熒光基團(tuán)，通過(guò)對(duì) PCR 過(guò)程中熒光信號(hào)的實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)，實(shí)現(xiàn)對(duì)核酸模板的定量分析，具體如下：

熒光信號(hào)產(chǎn)生機(jī)制

熒光染料法：常用的熒光染料如 SYBR Green I，它可以特異性地結(jié)合到雙鏈 DNA 的小溝部位。在 PCR 反應(yīng)體系中，當(dāng) DNA 進(jìn)行復(fù)制形成雙鏈時(shí)，SYBR Green I 就會(huì)結(jié)合到雙鏈 DNA 上，從而被激發(fā)產(chǎn)生熒光信號(hào)。而且熒光信號(hào)的強(qiáng)度與雙鏈 DNA 的含量成正比關(guān)系。

探針?lè)ǎ菏褂玫氖?TaqMan 探針等。TaqMan 探針是一段與目標(biāo) DNA 序列特異性互補(bǔ)的寡核苷酸，其 5' 端標(biāo)記有熒光報(bào)告基團(tuán)（如 FAM），3' 端標(biāo)記有熒光淬滅基團(tuán)（如 TAMRA）。在 PCR 反應(yīng)過(guò)程中，當(dāng)引物延伸到探針結(jié)合部位時(shí)，Taq 酶的 5' - 3' 外切酶活性會(huì)將探針降解，使得熒光報(bào)告基團(tuán)與淬滅基團(tuán)分離，從而產(chǎn)生熒光信號(hào)。每擴(kuò)增一條 DNA 鏈，就會(huì)有一個(gè)探針被切斷，釋放出一個(gè)熒光信號(hào)。

定量原理

標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)法：通過(guò)一系列已知濃度的標(biāo)準(zhǔn)品模板進(jìn)行 PCR 擴(kuò)增，得到不同濃度標(biāo)準(zhǔn)品對(duì)應(yīng)的熒光信號(hào)值，以標(biāo)準(zhǔn)品的起始拷貝數(shù)的對(duì)數(shù)為橫坐標(biāo)，以對(duì)應(yīng)的熒光閾值循環(huán)數(shù)（Ct 值）為縱坐標(biāo)，繪制出標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)。在相同條件下對(duì)未知樣品進(jìn)行 PCR 擴(kuò)增，根據(jù)其得到的 Ct 值，從標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)上就可以計(jì)算出未知樣品的起始拷貝數(shù)。

Ct 值的定義與應(yīng)用：Ct 值是指在 PCR 擴(kuò)增過(guò)程中，熒光信號(hào)開(kāi)始由本底進(jìn)入指數(shù)增長(zhǎng)階段的拐點(diǎn)所對(duì)應(yīng)的循環(huán)次數(shù)。研究表明，在 PCR 反應(yīng)的指數(shù)增長(zhǎng)期，Ct 值與起始模板量的對(duì)數(shù)呈線(xiàn)性關(guān)系，即起始模板量越多，Ct 值越?。环粗?，起始模板量越少，Ct 值越大。因此，可以利用 Ct 值來(lái)對(duì)模板進(jìn)行定量分析。

熒光檢測(cè) PCR 定量，即實(shí)時(shí)熒光定量 PCR（qPCR），具有以下優(yōu)點(diǎn)：

靈敏度高：能夠檢測(cè)到極低拷貝數(shù)的核酸模板，可對(duì)痕量核酸進(jìn)行定量分析，比如在病毒感染早期，血液中病毒核酸含量極低時(shí)，也能準(zhǔn)確檢測(cè)出病毒的存在并進(jìn)行定量，有助于疾病的早期診斷。

特異性強(qiáng)：無(wú)論是使用熒光染料法還是探針?lè)?，都具有很高的特異性。探針?lè)ㄖ?，TaqMan 探針與目標(biāo) DNA 序列特異性互補(bǔ)結(jié)合，只有當(dāng)引物和探針都與目標(biāo)序列準(zhǔn)確結(jié)合時(shí)才能產(chǎn)生熒光信號(hào)，極大地提高了檢測(cè)的特異性；熒光染料法中，SYBR Green I 只結(jié)合雙鏈 DNA，且在 PCR 引物設(shè)計(jì)時(shí)會(huì)確保其與目標(biāo)序列特異性結(jié)合，從而保證了檢測(cè)的特異性。

精確性好：通過(guò)對(duì)熒光信號(hào)的實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)和對(duì) Ct 值的精確測(cè)定，以及標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的建立，能夠?qū)崿F(xiàn)對(duì)核酸模板的準(zhǔn)確定量。實(shí)驗(yàn)結(jié)果的重復(fù)性好，變異系數(shù)通常較低，在科研和臨床診斷等領(lǐng)域能夠提供可靠的數(shù)據(jù)。

快速高效：整個(gè) PCR 過(guò)程在封閉的反應(yīng)體系中進(jìn)行，無(wú)需像傳統(tǒng) PCR 那樣在反應(yīng)結(jié)束后進(jìn)行開(kāi)蓋檢測(cè)，減少了操作步驟和時(shí)間，同時(shí)也降低了污染的風(fēng)險(xiǎn)。一般在 1 - 2 小時(shí)內(nèi)就能完成檢測(cè)，能夠快速得到檢測(cè)結(jié)果，適用于緊急情況和大規(guī)模樣本的檢測(cè)。

高通量：可以同時(shí)對(duì)多個(gè)樣本進(jìn)行檢測(cè)，配合自動(dòng)化的儀器設(shè)備，能夠?qū)崿F(xiàn)一次運(yùn)行檢測(cè)幾十甚至上百個(gè)樣本，大大提高了檢測(cè)效率，適用于大規(guī)模的疾病篩查、基因表達(dá)分析等研究和應(yīng)用。

實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)：在 PCR 擴(kuò)增過(guò)程中實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)熒光信號(hào)的變化，能夠直接觀(guān)察到核酸擴(kuò)增的動(dòng)態(tài)過(guò)程，了解反應(yīng)的進(jìn)程和效率，及時(shí)發(fā)現(xiàn)異常情況，如引物二聚體的形成、非特異性擴(kuò)增等，有助于對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行準(zhǔn)確的分析和判斷。